西尼罗病毒（WNV）是一种通过蚊子传播的复发性RNA病毒，可引起全球重大脑炎疫情。然而，目前还没有针对WNV的治疗方法，目前的治疗效果取决于症状的轻重。因此，鉴于病毒对动物和人类健康构成的威胁，迫切需要制定一种便捷策略来鉴别和评估抗病毒化合物。病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是开发抗RNA病毒药物的相关靶点，负责病毒基因组在宿主细胞内的复制。基于RdRps对RNA的特异性及其在感染传播中的重要作用，RdRps是关键的治疗靶点。我们开发了一种基于荧光的方法，可快速、可靠地实时测量WNV RdRp活性。有趣的是，在该实验中，利匹韦林显示出对WNV RdRp活性的抑制作用，IC50 值为3.3μM，其抗病毒活性在细胞培养中得到证实。此外，该方法已用于构建高通量筛选平台，用以验证WNV聚合酶抑制剂的效果。通过筛选一个小型化学文库，发现了新RdRp抑制剂1-4。在细胞培养中进行了WNV抗病毒活性测试，其中RdRp抑制剂4的EC50  值为2.5 μM，选择性指数为12.3。因此，利匹韦林是一种值得关注的候选药物，可用于治疗黄病毒属。此外，本文建立的方法可用于快速验证新WNV RdRp抑制剂的效果。