猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的成员，可导致新生仔猪急性腹泻和/或呕吐、脱水和高死亡率，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。目前商业化PEDV疫苗对变异和进化的病毒株的效果有限。尚无治疗PEDV感染的特效药。迫切需要开发更有效的治疗PEDV的药物。我们先前的研究表明，猪乳小细胞外囊泡（sEV）可促进肠道发育，防止脂多糖引起肠道损伤。然而，猪乳sEV对病毒感染的影响尚不清楚。本研究发现，使用分布超高速离心技术分离、纯化的猪乳sEV可抑制PEDV在IPEC-J2和Vero细胞中的复制。同时，构建了仔猪肠道类器官PEDV感染模型，发现猪乳sEV也可抑制PEDV感染。体内实验表明，猪乳sEV预饲可有效保护仔猪，使其免受因PEDV感染引起的腹泻和死亡率的影响。值得注意的是，研究发现从猪乳sEV中提取的miRNA抑制了PEDV感染。miRNA-seq、生物信息学分析和实验验证表明，在猪乳sEV靶向PEDV N和宿主HMGB1中发现的miR-let-7e和miR-27b可抑制病毒复制。综上所述，该研究发现了猪乳sEV抗PEDV感染的生物学功能，证明了其负载的miRNA、miR-let-7e和miR-27b具有抗病毒功能。本研究首次描述了猪乳sEV调节PEDV感染的新功能，有助于更好地了解猪乳sEV对冠状病毒感染的抑制作用，为进一步研究开发sEV作为一种抗病毒药物提供了依据。